Το γονίδιο είναι ένα τμήμα του DNA το οποίο κωδικοποιεί ένα μήνυμα για την σύνθεση μιας πρωτεΐνης συμπεριλαμβανομένου του μηχανισμού που ελέγχει την έκφραση αυτής της πληροφορίας. Ο όρος γονιδίωμα αναφέρεται στην συνολική γενετική πληροφορία που φέρει ένα κύτταρο ή ένας οργανισμός. Η γενωμική ή γονιδιωματική είναι η μελέτη της δομής και της λειτουργίας του γενετικού υλικού στα χρωμοσώματα. Οι εντυπωσιακές επιτυχίες της γενωμικής έχουν αποκαλύψει ολόκληρες αλληλουχίες DNA για αρκετούς οργανισμούς. Με την εμφάνιση των μικροπλακιδίων γονιδίων και των μικροσυστοιχιών γονιδίων, η γενωμική έχει περάσει σε μια λειτουργική φάση όπου η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται μέσω ανίχνευσης και προσδιορισμού ειδικών για γονίδια, αλληλουχιών RNA. Παρ’ όλ’ αυτά, μια πλήρης κατανόηση της μοριακής διαδικασίας που οδηγεί σε ασθένεια απαιτεί μια πιο σφαιρική προσέγγιση. Για παράδειγμα, χρειάζεται λεπτομερής γνώση όχι μόνο για το DNA και το RNA, αλλά και για αρκετές πλευρές των παραγόμενων πρωτεϊνών, από την βιοσύνθεση τους και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις τους (post-translational modifications, PTM) έως τις λειτουργίες τους και τις αλληλεπιδράσεις τους.

 Ο όρος πρωτέωμα αναφέρεται στο συνολικό πρωτεϊνικό συμπλήρωμα που κωδικοποιείται και εκφράζεται από ένα γονιδίωμα. Ο όρος πρωτεωμική αναφέρεται στη συστηματική μελέτη του συνολικού πρωτεϊνικού συμπληρώματος που εκφράζεται από το γονιδίωμα ή από συγκεκριμένα κύτταρα ή ιστούς, υγιών ή ασθενών. Τα μεταγραφήματα είναι υποσύνολα γονιδίων που μεταγράφονται ή εκφράζονται σε συγκεκριμένο κύτταρο ή ιστό. Η έκφραση αυτών των γονιδίων παρέχει πληροφορίες για τα μηνύματα που υπάρχουν σε ένα κύτταρο σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή και επομένως για τις δυναμικές σχέσεις μεταξύ γονιδιώματος, πρωτεώματος και κυτταρικού φαινοτύπου (σχήμα 6.1).

Οι στόχοι της πρωτεωμικής μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες: α) προσδιορισμός πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, β) συγκρίσεις διαφορικής έκφρασης συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε υγιείς και παθολογικές καταστάσεις και  γ) μελέτες αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών. Άλλες πλευρές της πρωτεωμικής περιλαμβάνουν την συμμετοχή των πρωτεϊνών σε μεταβολικά μονοπάτια και σε νέες προσεγγίσεις για την ανάπτυξη φαρμάκων. Όταν δεν είναι γνωστό κανένα εναρκτήριο σημείο για την εξέταση ενός βιολογικού προβλήματος, η προσέγγιση είναι η σφαιρική πρωτεωμική, δηλαδή η ανάλυση ολόκληρου του πρωτεϊνικού περιεχομένου κατά τη διάρκεια σειράς αλλαγών σε ένα κυτταρικό σύστημα.
Τέτοια ανάλυση περιέχει την εμφάνιση και την ποσοτικοποίηση όλων των πρωτεϊνών στο σύστημα αυτό και τον προσδιορισμό εκείνων που εκφράζουν ποσοτικές αλλαγές. Αντίθετα, η στοχευμένη πρωτεωμική ερευνά τη λειτουργία συγκεκριμένων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης της μελέτης των φυσικών σχέσεων τους με άλλες πρωτεΐνες. Πρέπει να είναι γνωστό ένα μοριακό σημείο έναρξης, δηλαδή μια καθορισμένη βιοχημική διαδικασία ή αντίδραση και να υπάρχει η υπόθεση ότι κάθε πρωτεΐνη που εμφανίζεται να έχει συγγένεια με αυτό το σημείο έναρξης, έχει έναν λειτουργικό ρόλο στην βιολογική διαδικασία που μελετάται. Ο καθαρισμός των σχετιζόμενων πρωτεϊνών είναι το πιο κρίσιμο στάδιο σε αυτήν την προσέγγιση και η ανάπτυξη κατάλληλων τεχνολογιών για την εύρεση και τον προσδιορισμό των μορίων που αλληλεπιδρούν με μια κύρια πρωτεΐνη, αποτελεί σήμερα ένα ενεργό πεδίο.

Οι δύο συνεισφορές της φασματομετρίας μαζών που την έχουν κάνει απαραίτητο εργαλείο στην πρωτεωμική είναι η ικανότητα προσδιορισμού απόλυτων μοριακών μαζών καθώς και η ικανότητα παροχής πληροφοριών για αλληλουχίες μερικώς είτε ακόμα και πλήρως.  Αρκετές στρατηγικές και τεχνικές φασματομετρίας μαζών έχουν αναπτυχθεί για εφαρμογές που ποικίλουν από τον προσδιορισμό και το χαρακτηρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών μέχρι την εξερεύνηση των βιολογικών συνεπειών από τις αλλαγές στις ανώτερες δομές των πρωτεϊνών.

Υπάρχουν πέντε τουλάχιστον βασικές στρατηγικές για τον προσδιορισμό πρωτεϊνών: α) χρήση δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης (2-distance electrophoresis, 2-DE) για διαχωρισμό των πρωτεϊνών που ακολουθείται από προσπάθεια αναγνώρισης των συστατικών, με σύγκριση των ισοηλεκτρικών τους σημείων και των κατά προσέγγιση μοριακών μαζών και ακολούθως με χρήση πληροφοριών που διατίθενται σε βάσεις δεδομένων, β) χρήση  2-DE για διαχωρισμό, ενζυμική πέψη των πρωτεϊνικών κουκίδων που ενδιαφέρουν, διαχωρισμός των πεπτιδίων με HPLC και προσδιορισμό των χρόνων ανάσχεσης, λαμβάνοντας τις πεπτιδικές αλληλουχίες με χημεία Edman και προσδιορισμό με αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων, γ) διαχωρισμός με 2-DE ή με άλλες τεχνικές που ακολουθείται από εκτεταμένη πρωτεόλυση των πρωτεϊνών, προσδιορισμό των μικρότερων πεπτιδίων που παράγονται, με χρήση φασματομετρίας μαζών και προσδιορισμό των πρωτεϊνών με αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων (“bottom up” προσέγγιση), δ) Απευθείας εύρεση αλληλουχίας της πρωτεΐνης στην αέρια φάση για την παραγωγή ενός συμπληρωματικού συνόλου θραυσμάτων που τελικά συνθέτουν ολόκληρη την πρωτεΐνη (“top down” προσέγγιση) και ε) εφαρμογή τεχνικών με υψηλή ακρίβεια μάζας για απευθείας προσδιορισμό.   

Από τις παραπάνω προσεγγίσεις, η τρίτη (“bottom up”- σχήμα 6.2 ) είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τέσσερα διακριτά συνεχόμενα στάδια: α) από την προετοιμασία του δείγματος έως την απεικόνιση του 2-DE ηλεκτροφορήματος, β) από την απεικόνιση έως την πέψη των κουκίδων, γ) από την ενζυμική πέψη έως την αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων και δ) από την αναζήτηση έως την ανάλυση των δεδομένων και την αρχειοθέτηση. Η φασματομετρία μαζών παίζει κύριο ρόλο στο τρίτο στάδιο, συμπεριλαμβανομένων των σταδίων καταγραφής των πεπτιδικών μαζών, συλλογής MS/MS δεδομένων και ανάλυση μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Μια συνηθισμένη στρατηγική φασματομετρίας μαζών αρχίζει με ενζυμική πέψη εντός του gel των πρωτεϊνικών δειγμάτων που έχουν διαχωριστεί με 2-DE και ακολουθεί ανάλυση με χρήση MALDI TOF MS για χαρτογράφηση μαζών του πεπτιδικού δείγματος. Μόνο το 2-10% του πεπτιδικού δείγματος καταναλώνεται σε αυτή την ανάλυση. Αν η αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων είναι αρνητική, τότε ένα μεγαλύτερο ποσοστό του πεπτιδικού μίγματος (~50%) μπορεί να αναλυθεί με nano-ESI-MS/MS για την λήψη αλληλουχιών ώστε να ενσωματωθούν στην αναζήτηση από βάσεις δεδομένων. Αν και αυτή η προσέγγιση αποτύχει τότε χρειάζεται de novo (εξ αρχής) εύρεση αλληλουχίας από τα MS/MS φάσματα μαζών των πεπτιδίων. Έχουν επίσης αναπτυχθεί αρκετές διαφοροποιήσεις αυτής της γενικής προσέγγισης οι οποίες δεν περιλαμβάνουν καθόλου 2-DE.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. John Roboz, Mass spectometry in cancer reasearch, CRC press, 2002
2. Satoko Akashi, Investigation of Molecular Interaction Within Biological Macromolecular Complexes by Mass Spectrometry, Medicinal Research Reviews, Vol. 26, No. 3, 339-368, 2006.
3. Barbara Comuzzi, Marianne D Sadar, Proteomic analyses to identify novel therapeutic targets for the treatment of advanced prostate cancer, Nature reviews drug discovery, volume 2, 2003.
4. John R. Yates, Mass spectral analysis in proteomics, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 33:297–316, 2004
5. Tom Berkelman and Tirra Stenstedt, 2-D Electrophoresis Principles and Methods, Amersham Biosciences AB
6. Scott D. Patterson, Ruedi H. Aebersold,  Proteomics: The first decade and beyond, nature genetics supplement;33, 2003
7. Julia D. Wulfkuhle, Lance A. Liotta, Emanuel F. Petricoin, Proteomic applications for early detection of cancer, nature reviews cancer; 3, 2003

Συγγραφή και επιμέλεια κειμένου : Ρουμελιώτης Θεόδωρος