Ο 21ος αιώνας έχει δικαίως χαρακτηρισθεί ως ο αιώνας της βιολογίας. Ήδη από τα τέλη του προηγούμενου αιώνα η αλματώδης ανάπτυξη της μοριακής βιολογίας επέφερε στην επιστημονική κοινότητα σπουδαίες ανακαλύψείς, μεταξύ των οποίων και η διάσημη διπλή έλικα του μορίου DNA. Μόλις το 2001 αποκρυπτογραφήθηκε το ανθρώπινο γονιδίωμα και οι επόμενες δεκαετίες αναμένονται καταλυτικές για τον τομέα αυτό. Όπως ήταν αναμενόμενο, συναφείς επιστήμες κλήθηκαν, ή και απαίτησαν, να συνεισφέρουν στην ανάπτυξη αυτή, μεταξύ των οποίων και η χημεία. Σημαντική βεβαίως παραμένει η συνδρομή της φυσικοχημείας η οποία έχει προσφέρει στην βιολογία σημαντικές φασματοσκοπικές μεθόδους, εργαλεία για την ανάλυση και ταυτοποίηση των βιομορίων.

Mεταξύ των πρώτων μετρήσεων που χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό βιοπολυμερών υπήρξε ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους. Μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του ’70, οι μόνες τεχνικές που εφαρμόζονταν για αυτόν τον σκοπό ήταν η ηλεκτροφορετικές, χρωματογραφικές και υπερφυγοκεντρικές μέθοδοι. Οι τεχνικές αυτές υστερούσαν σε ακρίβεια (σχετικό σφάλμα 10-100%) λόγω της ευαισθησίας τους και σε άλλα χαρακτηριστικά πλην του μοριακού βάρους, όπως η διαμόρφωση του μορίου, η ακτίνα Stokes και η υδροφοβικότητα τους. Επομένως, ο μοναδικός τρόπος να γνωρίζουμε το ακριβές μοριακό βάρος των μακρομορίων ήταν μέσω υπολογισμών βασισμένων στη χημική τους δομή.

Μια φασματοσκοπική μέθοδος η οποία γρήγορα βρήκε εφαρμογή στην ανάλυση των βιολογικών προϊόντων είναι η φασματομετρία μάζας. Η αρχή λειτουργίας της συγκεκριμένης μεθόδου είναι αρκετά απλή. Το πρώτο βήμα είναι η  παρασκευή ιόντων του δείγματος στην αέρια φάση μέσω πχ. ηλεκτρονιακού ιοντισμού (Μ + e- -->  M·⁺ + 2e-). Αυτό το μοριακό ιόν υποβάλλεται σε διάσπαση. Λόγω του ότι το ριζικό κατιόν έχει περιττό αριθμό ηλεκτρονίων, μπορεί να διασπαστεί είτε σε μια ρίζα κι ένα ιόν με άρτιο αριθμό ηλεκτρονίων, είτε σε ένα μόριο κι ένα νέο ριζικό κατιόν.  Κάθε αρχικό παράγωγο ιόν που προκύπτει από το μοριακό ιόν μπορεί να υποστεί περαιτέρω διάσπαση. Όλα αυτά τα ιόντα διαχωρίζονται στο φασματόμετρο ανάλογα με τον λόγο μάζας προς φορτίο (m/z). Τα περισσότερα ιόντα έχουν φορτίο που αντιστοιχεί σε απομάκρυνση ενός ηλεκτρονίου. Μπορούν όμως να βρεθούν πολλαπλά φορτισμένα ιόντα, τα οποία εμφανίζονται σε αντιστοιχία με το λόγο μάζα προς φορτίο.  Τα ιόντα προσφέρουν πληροφορία που αφορά την φύση και την δομή των πρόδρομων μορίων. Σε ένα φάσμα καθαρής ουσίας, το μοριακό ιόν, αν υπάρχει, εμφανίζεται με την μεγαλύτερη τιμή m/z (ακολουθούμενο από ιόντα που περιέχουν βαρύτερα ισότοπα) και μας δίνει το μοριακό βάρος (ΜΒ) της ουσίας.

To πρώτο τμήμα της πειραματικής διατάξεως είναι η πηγή ιόντων, στο οποίο το υπό εξέτασιν δείγμα ιονίζεται πριν ξεκινήσει η ανάλυσή του. Οι πηγές ιόντων παράγουν κυρίως ιόντα από ιοντισμό ενός ουδετέρου μορίου μέσω εκτίναξης και κατάληψης ηλεκτρονίων, πρωτονίωσης, αποπρωτονίωσης, σχηματισμό συμπλεγμάτων ή μεταφορά φορτισμένου σωματιδίου από συμπυκνωμένη φάση στην αέρια φάση. Η παραγωγή ιόντων συχνά εμπεριέχει αντιδράσεις ιόντος-μορίου στην αέρια φάση. . Στην φασματομετρία μάζας χρησιμοποιούνται μια πληθώρα τεχνικών ιοντισμού, μεταξύ των οποίων η μέθοδος βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment, FAB), ο ιοντισμός εκρόφησης με την βοήθεια υλικού μήτρας (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) και ο ηλεκτροψεκασμός (ElectroSpray Ionization, ESI).

Από την στιγμή που τα ιόντα έχουν παραχθεί, πρέπει να διαχωριστούν ανάλογα με την μάζα τους, την οποία είναι και η ζητούμενη. Τα τρία βασικά χαρακτηριστικά του αναλυτή είναι το άνω όριο ανίχνευσης μάζας, η μετάδοση και η διακρισιμότητα. Το όριο ανίχνευσης μας καθορίζει την υψηλότερη τιμή του λόγου μάζας προς φορτίο (m/z) που μπορεί να μετρήσει ο συγκεκριμένος αναλυτής. Με τον όρο μετάδοση εννοούμε τον λόγο μεταξύ τον αριθμό των ιόντων που φτάνουν στον ανιχνευτή και στον αριθμό των ιόντων που παράγει η πηγή. Τέλος, η διακριτική ικανότητα ή διακρισιμότητα είναι η ικανότητα να αποδίδει ξεχωριστά σήματα για δύο ιόντα με μικρή διαφορά μάζας. Για να καταφέρουμε να αναπαραγάγουμε δεδομένα για τον προσδιορισμό δομής, το υπό μελέτη μόριο πρέπει να διασπαστεί (θραυσματοποιηθεί) σε ένα ή περισσότερους δεσμούς, ώστε να μπορέσουμε να αντιστοιχήσουμε τον λόγο m/z των θραυσμάτων που λαμβάνουμε με την χημική του δομή.

H τεχνική ανάλυσης πεπτιδίων με γνωστή αλλά και άγνωστη αλληλουχία αμινοξέων μέσω φασματόμετρων μάζας σε σειρά (tandem MS), μας επιτρέπει να αναγνωρίσουμε τις διαδικασίες θραυσματοποίησης. Τα θραύσματα μπορούν να διαχωριστούν σε δύο κατηγορίες, σε θραύσματα που προκύπτουν από σπάσιμο ενός ή δύο δεσμών της πεπτιδικής αλυσίδας και σε θραύσματα που δημιουργούνται από σπάσιμο δεσμών των αμινοξέων κάθετων στην πεπτιδική αλυσίδα.

Επειδή η φασματομετρία μάζας διαφέρει εξ ολοκλήρου από οποιαδήποτε άλλη τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας αμινοξέων, προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα έναντι των υπολοίπων, όπως η ανάλυση πεπτιδίων σε μίγμα και πεπτιδίων με προστατευμένο το Ν-άκρο. Το γεγονός αυτό την καθιστά συμπληρωματική μέθοδο των υπολοίπων. Επίσης, η φασματομετρία μάζας είναι πιο ευαίσθητη και πιο γρήγορη, καθώς ένα τέτοιο φάσμα χρειάζεται μονάχα λίγα λεπτά για να ληφθεί. Εντούτοις, η ερμηνεία ενός φάσματος μάζας απέχει πολύ από τον χαρακτηρισμό “εύκολη υπόθεση”. Συγκεκριμένα, η ερμηνεία των θραυσμάτων είναι δύσκολη και χρονοβόρα. Όμως, μπορεί να απλοποιηθεί αν το πεπτίδιο τροποποιηθεί κατά τέτοιον τρόπο ώστε να εκβιάσουμε από την μέθοδο να προτιμήσει ένα συγκεκριμένο θραύσμα.

Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας, βασισμένος στην θραυσματοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων στην αέρια φάση και στην διαδοχική ταυτοποίηση των θραυσμάτων αποτελεί μια ενδιαφέρουσα διαδικασία και αποτελεί τον πιο γρήγορο τρόπο εύρεσής της. Ο φωσφοδιεστερικός δεσμός είναι αυτός που σπάει και δημιουργεί τα παραγόμενα θραύσματα. Παρόλα αυτά, το φάσμα που λαμβάνουμε είναι εξαιρετικά πολύπλοκο και δύσκολο πολλές φορές να ερμηνευθεί. Χρειάζεται μεγάλη διακριτική ικανότητα ώστε να διαχωριστούν τα παραγόμενα θραύσματα και η διευκρίνιση της μάζας πρέπει να είναι αρκετά ακριβής ώστε να γίνει σωστή αντιστοίχηση των θραυσμάτων.

Eπί προσθέτως, η φασματομετρία μάζας χρησιμοποιείται και στην ανάλυση ολιγοσακχαρητών και λιπιδίων, όπου τα παραγόμενα θραύσματα είναι χαρακτηριστικά της δομής τους.

Συγγραφή και επιμέλεια : Βογιατζής Κωνσταντίνος

Βιβλιογραφία

1. Hoffmann, E., Stroobant, V., Mass Spectrometry: Principles and Applications, 2nd Ed.; John Wiley & Sons: Chishester, England, 2002.
2. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A., Αρχές Ενόργανης Ανάλυσης, 5η Έκδοση; Εκδόσεις Κωσταράκης, Αθήνα, 2002.
3.   Papayannopoulos, I. A., Mass Spectrom. Rev. 1995, 14, 49.